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荧光原位杂交(FISH)介绍

来源:作者: 时间:2015-04-01 08:55:20

 

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1、荧光原位杂交原理
FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的,二者经变性-退火-复性,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛,可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应,经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
2、荧光原位杂交特点
原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高,可以通过延长曝光时间加强信号强度,故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足,这就是FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系,有以下特点。
荧光原位杂交优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定,一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列,其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化,也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
荧光原位杂交缺点:不能达到100%杂交,特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。
3、荧光原位杂交实验流程
FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→(染色体显带)→荧光显微镜检测→结果分析。
4、荧光原位杂交应用
荧光原位杂交技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位,而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。
荧光原位杂交技术最初用于中期染色体。从正在分化的细胞核中制备的这种染色体是高度凝缩的,每条染色体都具有可识别的形态,它们染色后将显现出特征性的着丝粒位置及染色带型。在处理中期染色体时,通过测定FISH所获得荧光信号相对于染色体短臂末端的位置(FLpter值)来进行作图。使用中期染色体的不足之处在于,由于它的高度凝缩的性质,只能进行低分辨率作图,两个标记至少分隔1Mb才能作为分开的杂交信号被分辨出来(Trask et al.,1991)。这种分辨率不足以构建有交往的染色体图谱。故此中期染色体FISH主要用于确定新标记在染色体上的大概位置,为其他更精细的作图方法做准备。 一直以来,这些“其他方法”并不包括任一种FISH,但1995年后,一系列高分辨率的FISH技术已发展起来。这些技术通过改变待研究的染色体制备的性质而达到较高的分辨率。中期染色体对于精细作图来说凝缩度太高,因而我们需要选用较为伸展的染色体。有两种途径可以满足这一要求(Heiskanen et al.,1996): 机械伸展的染色体(mechanically stretched chromosome)通过改变从中期细胞核中分享染色体的方法而获得。离心产生剪切力可将染色体伸展到正常长度20倍。每条染色体仍可识别,而FISH信号作图方法与通常处理的中期染色体相同,这样,分辨率可明显提高,能够区分出相隔200~300kb的标记。 非中期染色体(non-metaphase chromosome)染色体仅在中期高度凝缩,而在细胞周期的其他阶段保持天然未包装状态,有研究者曾利用前期细胞核,此时染色体凝缩程度足以区分出单个染色体。实际应用中,这种方法并无优于机械伸展的染色体之处。相比之下分裂间期(interphase)的染色体更为有用,因为分裂间期(再次细胞核分裂之间)的染色体包装程度最低。使用分裂间期的染色体,分辨率有可能达到25kb以下,但染色体形态特征消失,推动了定位探针位置所需的外部参照点。因此,该技术可在已获得染色体粗略图谱后使用,通常作为确定染色体一段小区域内一系列标记物顺序的方法。 间期染色体含有去组装的全部的细胞DNA分子。为了进一步提高FISH的分辨率到25kb以下,有必要放弃完整的染色体,而使用纯化的DNA。这种方法叫做纤维-FISH(fiber-FISH),利用凝胶拉伸或分子梳理技术制备DNA,可以分辨间距小于10kb的标记。
 

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